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艾偉拓AVT上新啦C12-200:如何從126種組合中脫穎而出

更新時間:2023-08-14   點擊次數(shù):2322次

好消息一:

C12-200有效遞送siRNA[1],通過組合篩選,可實現(xiàn)低劑量,高效率的基因沉默效果。


好消息二:

AVTC12-200已上線,歡迎詢價采購。

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在發(fā)現(xiàn)和開發(fā)能夠引導小干擾RNA(SiRNA)通過許多屏障保護目標細胞內(nèi)部的載體方面,人們做出了巨大的努力。雖然研究已經(jīng)顯示基因沉默在體內(nèi)的潛力,但要發(fā)揮RNA干擾療法的zui廣泛潛力,必須提高給藥效果。通過組合,合成和篩選不同類別的材料,已經(jīng)確定了一種能使siRNA引導的小鼠肝臟基因沉默的配方,其劑量低于0.01毫克/千克。這種制劑在一次注射后還能同時抑制五個肝基因的表達。這種制劑的潛力在非人類靈長類動物中得到進一步驗證,在這種情況下,在低至0.03mg/kg的劑量下,觀察到臨床相關(guān)基因轉(zhuǎn)胸腺肽的高度敲除水平。據(jù)文章所示,這種制劑有助于基因沉默,其劑量比任何先前描述的siRNA肝傳遞系統(tǒng)所要求的低一個數(shù)量級。

 

Lipidoid-siRNA制備

Lipidoid-siRNA制劑的體內(nèi)篩選是由類脂,膽固醇,和PEG脂質(zhì)組成。在100、20100 mg/mL的無水乙醇中分別溶解得到了類脂、膽固醇和DMG-mPEG 2000的原液。各組分按照比例組合,質(zhì)量比為522028。在200 mM的醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)中加入有機相,攪拌形成空脂質(zhì)體。在50 mm的醋酸鈉溶液中加入10 mg/mLsiRNA,以總脂質(zhì):siRNA101的比例,將siRNA加入空脂質(zhì)體中,在37?℃下孵育30 min。然后用3,500 MWCO的透析盒(皮爾斯)PBS進行透析75 min。在緩沖液交換后,每種制劑的樣品被用于粒子的表征。采用改良的RiboGreen(Invitrogen)定量siRNA的包封率,用動態(tài)光散射法測量平均粒徑。

Jeffs等人提出的方法制備了C12-200-siRNA。用90%乙醇(摩爾比501038.51.5)C12-200、DSPC、膽固醇和mPEG 2000-DMG進行增溶。siRNA10 mm檸檬酸鹽溶液中溶解(pH3.0,緩沖液濃度為0.4mg/mL)。用裝有雙相泵頭的蠕動泵,在等效體積流量下,混合在“T"結(jié)中,對乙醇脂質(zhì)溶液和siRNA水溶液進行了泵提。脂質(zhì)與siRNA的結(jié)合比例為71(wt:wt)。用PBS(155 mm NaCl3mm Na2HPO4,1mm KH2PO4,pH7.5)對自發(fā)形成的C12-200-siRNA進行透析,去除乙醇和交換緩沖液。

組合設計

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1:通過組合,設計了陽離子脂質(zhì)化合物庫。

基于脂質(zhì)的載體介導的siRNA體外釋放。

以熒光素酶表達的Hela衍生細胞株為研究對象,以高通量的方式篩選脂質(zhì)類材料。對這些細胞進行基因修飾,穩(wěn)定表達酶。在本實驗中,以質(zhì)量比2.5151,101151的脂質(zhì):siRNA進行絡合,并與細胞在生長培養(yǎng)基中孵育。熒光素酶的表達在不發(fā)生腎素還原的情況下被認為是siRNA介導的沉默,而renilla的表達被作為脂質(zhì)相關(guān)毒性的內(nèi)部對照。細胞毒性試驗也沒有任何不良反應的證據(jù)。在這個篩選中,發(fā)現(xiàn)了許多有助于熒光素酶沉默的化合物,其中三個化合物的沉默率超過90%。為了便于展示,只顯示了51的質(zhì)量比的數(shù)據(jù)。有趣的是,從這些結(jié)果中出現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)-活動關(guān)系。就尾部長度而言,在15種性能好的結(jié)構(gòu)中,有7種結(jié)構(gòu)的尾長為14碳。此外,尾巴長度小于12-碳的化合物也不會引起大于30%的沉默。在頭部基團設計中,amine 113存在于前兩種化合物和前15種化合物中的三種。雖然在C14尾和amine 113上的趨同是明顯的,但并不是所有含有這些結(jié)構(gòu)的化合物都表現(xiàn)出沉默活性。例如,在體外,C8-113C14-116都不能促進基因沉默,這表明通過優(yōu)化胺基和尾長的組合來提高傳遞效率是必要的。

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2:脂質(zhì)體庫的體外篩選

在表達熒光素酶的Hela細胞中,對脂質(zhì)體進行篩選。(A)將抗熒光素酶的siRNA與可電離陽離子脂質(zhì)復合,與培養(yǎng)基中的細胞共同孵育。(B)小劑量siRNA沉默熒光素酶。

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3:在小鼠體內(nèi)沉默FVII因子。

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4:通過檢測FVII蛋白水平,觀察C12-200介導的基因沉默在體內(nèi)持續(xù)時間超過40天。

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5:五個位于肝臟的基因靶點。

據(jù)我們所知,這是關(guān)于siRNA介導的五個肝臟靶點在體內(nèi)同時沉默的最早報道??紤]到C12-200介導的遞送的效力,我們假設更多的基因可以同時被合并的siRNA產(chǎn)物沉默。從治療的角度來看,這可以實現(xiàn)更復雜的治療方法,其中多個靶點的沉默可以獲得增強的治療效果。例如,這種策略可能特別適用于治療病毒感染,如丙型肝炎病毒(HCV),在這種病毒感染中,快速進化的病毒基因組已被證明對單一序列的siRNA難以實現(xiàn)。事實上,這一想法以前已經(jīng)在體外證明,利用核糖核酸內(nèi)切酶制備的siRNA和編碼針對HCV基因組多個區(qū)域的短發(fā)夾RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進行遞送。這種多靶點治療方法還可以采用不同的策略來治療多因素疾病,如代謝綜合征、癌癥或感染性疾病

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6:C12-200-siRNA顆粒通過大細胞吞噬引起細胞攝取

A) 用C12-200配制的熒光標記的siRNAHeLa細胞在各種內(nèi)吞途徑的標記標記物存在下孵育。含有siRNA的顆粒與標記的葡聚糖共定位,葡聚糖是一種已知通過大細胞吞噬作用進入細胞的液相標記物(白色箭頭)。(B) 肌動蛋白纖維的熒光標記揭示了在HeLa細胞暴露于C12-200-siRNA顆粒的15分鐘內(nèi),膜褶皺(白色箭頭)和肌動蛋白重排,這是大胞飲攝取的標志性指標。(C,D)細胞先前暴露于EIPACytochalasin D,分別是大胞飲和肌動蛋白聚合的抑制劑,以劑量依賴性的方式減少C12-200-siRNA顆粒的攝取。(s.d.n=3,***P<0.005**P<0.01;*P<0.05

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7:C12-200對非人類靈長類動物的治療效果。

食蟹猴(每組n=3)通過頭靜脈接受PBS0.030.10.3 mg/kgC12-200中配制的siTTR,作為15分鐘的靜脈輸注(5 mL/kg)。在給藥后48小時從動物身上采集肝活檢。在肝臟樣品中測定TTR mRNA水平相對于GAPDH mRNA水平。數(shù)據(jù)點代表組平均值±s.d

 

本研究最終認為:開發(fā)安全有效的siRNA遞送載體是基于RNAi的治療方法持續(xù)進步的重要組成部分。隨著C12-200等高效材料的鑒定,可以實現(xiàn)更寬的治療指數(shù)、持久的基因沉默和多靶點治療疾病的方法。

 

Reference

[1]. Lipid-like materials for low-dose, in vivo gene silencing


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