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mRNA-LNP制劑中緩沖體系的篩選與評估

更新時間:2023-12-18   點擊次數(shù):2275次

上周,艾偉拓產(chǎn)品團隊分享了非脂質(zhì)藥用輔料對mRNA-LNP制劑穩(wěn)定性的影響。(參考閱讀:《非脂質(zhì)藥用輔料對mRNA-LNP穩(wěn)定性的影響及篩選考量》

本周,我們接著這個話題,通過一篇美國俄勒岡州立大學(xué)藥學(xué)院的研究論文,進一步討論緩沖體系對mRNA-LNP的影響,供大家參考

摘 要

該研究測試了三種常見生物緩沖液——HEPES、Tris和PBS——在單次凍融前后與DLin-MC3-DMA mRNA-LNP制劑的相容性。通過電子顯微鏡、差示掃描量熱法和膜流動性分析發(fā)現(xiàn),不同緩沖液使LNP形態(tài)發(fā)生了不同的結(jié)構(gòu)變化。采用體外和體內(nèi)模型測量mRNA轉(zhuǎn)染效率,發(fā)現(xiàn)Tris或HEPES緩沖液中的LNPs具有更好的冷凍保護效果以及與PBS相比更高的轉(zhuǎn)染效率

1.緩沖體系可能對LNP的性質(zhì)與穩(wěn)定性有較大影響

近年來,脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)作為treat多種遺傳疾病、疫苗和蛋白質(zhì)替代療法的非病毒核酸遞送平臺受到了wide—range關(guān)注。新冠mRNA-LNP疫苗的全球成功凸顯了基于LNP的核酸遞送潛力。

LNP配方的優(yōu)化取決于混合方法,速率,使用的溶劑,pH值中和和純化過程。

雖然LNPs通常被認為是凝聚態(tài)疏水材料,但它們可以捕獲大量的水,這取決于LNP的組分和其包載的mRNA分子。mRNA-LNPs水分含量可以高達30%,這表明LNP制劑中緩沖體系的選擇可能會對LNP的形成、性質(zhì)和穩(wěn)定性產(chǎn)生巨大影響,尤其是考慮到mRNA-LNPs溶液需要在零度以下的溫度下長期儲存的情況。

緩沖液在冷凍時的結(jié)晶會嚴重影響生物制劑的性質(zhì),并會導(dǎo)致LNP破裂和聚集,這在most近的報道中得到了證實。此外,緩沖液在凍結(jié)時的一個特殊性質(zhì)是誘導(dǎo)產(chǎn)生pH梯度。例如,常用的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)在冷凍時可以經(jīng)歷多達4個單位的pH變化。常見的糖類冷凍保護劑如海藻糖、蔗糖等可以一定程度上抑制這些影響,但無法消除。

據(jù)報道,磷脂頭部基團也會與緩沖體系相互作用,導(dǎo)致脂質(zhì)膜軟化。

因此,LNPs可能高度敏感于pH和膜彈性的動態(tài)變化,如緩沖體系類別、離子強度或溫度變化。

2該研究中LNP配方及表征方法

將螢火蟲熒光素酶(FLuc) mRNA用50 mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 4)和分子級水稀釋,達到所需體積。將DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇和DMG-PEG-2000溶解在總脂質(zhì)濃度為5.5 mM的純乙醇(摩爾比為50:10:38:1.5)中,以3:1的體積比(水/乙醇)和9 mL/min的總流速通過標準微流控混合制備LNPs。

制備用于透析的HEPES、Tris和PBS(詳見下圖a,Tris即為Tris Buffer,HBS即為HEPES Buffer),其鹽度為150 mM, pH為7.4。配制后,立即將LNPs轉(zhuǎn)移到10個kDa MWCO盒中,并在各自的緩沖液中以1000倍的體積透析4小時和過夜。透析后,LNPs在Amicon Ultra離心過濾裝置中以3000g離心濃縮,分子量截止為100 kDa(Millipore Sigma, Burlington, MA)。

使用Zetasizer Nano ZSP對LNPs進行了水動力尺寸、多分散性指數(shù)和表面zeta電位的表征。對于Zetasizer分析,LNPs在各自的緩沖液中稀釋,得到三次測量結(jié)果。為了量化mRNA的包封效率和濃度,采用了改進的Quanti-iT RiboGreen RNA(Invitrogen)方案。

3研究成果

3.1 緩沖液對LNP的形成和短期穩(wěn)定性的影響可以忽略不計

通過標準的微流體混合程序制備含有FLuc mRNA的LNP。DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇和DMG-PEG-2000脂質(zhì)按50:10:38.5:1.5摩爾比混合,pH 4檸檬酸緩沖液中的mRNA溶液與乙醇脂質(zhì)混合物的體積比為3:1,總流速為9 mL/min。然后將所得的LNP懸浮液分成三等份,分別與PBS、Tris或HEPES進行透析。

透析后,將LNPs濃縮,并通過動態(tài)光散射(DLS)和改進的核糖綠測定法進行分析。

DLS分析顯示,三種緩沖液中LNPs顆粒大小幾乎相同,約為70 nm,PDI約為0.05。

Zeta電位值表明,PBS和Tris配方的表面電荷略為負(約−3mV),HEPES配方的表面電荷為中性,三種緩沖液中包封率均為>92%。

LNP的冷凍透射電鏡顯微照片也沒有顯示任何outstanding的形態(tài)變化,這表明緩沖液對LNP的形成、形態(tài)或短期穩(wěn)定性的影響可以忽略不計。

3.2 低溫凍存復(fù)溶后,不同緩沖液中LNP關(guān)鍵表征出現(xiàn)差異

在- 20℃下保存三周后,將不同緩沖溶液中的LNPs在室溫下解凍30分鐘,立即用于研究。

①粒徑

儲存在HEPES和PBS中的樣品在FT后的平均粒徑增大了約50%,而儲存在Tris中的LNPs的粒徑減小了約10 nm。

②PDI

HEPES和Tris中LNPs的PDI在凍融前后基本保持一致,而PBS中LNPs在解凍后PDI增加了3倍(上圖b)。FT后Zeta電位也略有下降(上圖d)。

③LNP形態(tài)

LNP形態(tài)受到凍融的嚴重影響,冷凍透射電鏡證實PBS緩沖液中的 LNP在大小上most多樣化,并且顯示出高度異質(zhì)性的內(nèi)部組織,以及顆粒聚集。這可能是脂質(zhì)相和水相分離所導(dǎo)致。具體而言,PBS中的LNP包含典型的100 nm以下的致密LNPs,100~150nm的空脂質(zhì)體樣結(jié)構(gòu),以及不同粒徑包載水相的LNPs,其中部分水相中含有mRNA。

DLS分析顯示,Tris中的LNPs盡管觀察到形態(tài)變化,但尺寸和PDI沒有明顯變化,這表明相比于PBS,Tris可能可以更大程度地抑制LNPs顆粒的聚集。

與新鮮LNPs相比,HEPES中的LNPs在凍融后出現(xiàn)的沙漏狀結(jié)構(gòu),尺寸略大(見下圖e)。在LNPs周圍形成的水泡似乎缺乏mRNA,這可能表明HEPES可以影響mRNA周圍脂質(zhì)的堆積,例如,HEPES可以促進脂質(zhì)與mRNA之間更強的靜電相互作用——HEPES LNPs的zeta電位是真正的中性的,而PBS和Tris LNPs具有−2至−5 mV的輕微負電荷,這可能表明當HEPES存在時,mRNA電荷的中和作用更有效。

此外,基于冷凍顯微圖像研究了脂質(zhì)膜厚度的變化。

平均而言,脂膜厚度在FT后增加了15%,表明膜水合作用增加。

更具體地說,冷凍后,Tris LNPs的脂膜厚度增加了約0.8 nm, PBS增加了約0.6 nm, HEPES LNPs增加了約0.2 nm。尚不清楚這些改變是否表明脂質(zhì)膜成分發(fā)生變化或onlyonly是水摻入的結(jié)果,但這些結(jié)果突出了解凍后LNPs的脂質(zhì)膜發(fā)生了outstanding變化,且不同緩沖體系中變化程度不同。

以上實驗結(jié)果表明,不同緩沖液對mRNA-LNPs的關(guān)鍵表征(形態(tài)、粒徑、PDI,脂質(zhì)膜厚度等)可以產(chǎn)生較大影響。

3.3 轉(zhuǎn)染能力與內(nèi)涵體逃逸的體外評估

①緩沖液影響LNP轉(zhuǎn)染能力

該研究評估了不同緩沖液中的LNPs的轉(zhuǎn)染能力和內(nèi)涵體逃逸的程度。分別用包封FLuc mRNA的LNPs處理hela和HEK293T/17(后者用Gal9-GFP報告系統(tǒng)修飾)兩個細胞系,并在24小時后檢測。無論使用何種緩沖液,細胞存活率均保持在80%(下圖a,c)。轉(zhuǎn)染評價表明,緩沖液的轉(zhuǎn)染效率隨細胞系的不同而變化。在HeLa細胞中,LNPs轉(zhuǎn)染趨勢為HEPES>PBS>Tris(下圖b),而HEK293T/17細胞表現(xiàn)出Tris>HEPES>PBS的偏好(下圖d)。

一般來說,所有的mRNA-LNP制劑在解凍后轉(zhuǎn)染效果都有所下降。在HeLa細胞中,PBS LNPs的轉(zhuǎn)染效率下降most為嚴重,在所有處理中平均下降4倍,而HEPES在所有處理中平均下降2倍(下圖b)。對于HEK293T/17細胞系, HEPES和PBS LNPs均無統(tǒng)計學(xué)意義的下降,而Tris在100和200 ng時的LNPs分別下降了2 ~ 2.5倍(下圖d)。

②緩沖液影響內(nèi)涵體逃逸效率

凝集素是一個與病原體入侵和免疫感知相關(guān)的糖結(jié)合凝集素家族。半乳糖凝集素如gal3、gal8和gal9從彌漫的細胞質(zhì)表達重新分布到暴露的糖苷位點,這是由于內(nèi)體內(nèi)小葉暴露事件造成的,表明內(nèi)涵體破壞。Gal9已被證明在報告細胞內(nèi)涵體逃逸的檢測中具有most高的信噪比。因此,可利用Galectin 9 (Gal9)- gfp 修飾的HEK293T/17細胞系,評估FLuc mRNA LNPs的內(nèi)涵體逃逸情況。

低劑量處理(50 ng)在所有新鮮LNPs中幾乎沒有變化,HEPES LNPs在FT后表現(xiàn)出most高的Gal9募集和mostoutstanding的變化(2.6倍)。

高劑量(200ng)處理組中,冷凍前Tris LNPs誘導(dǎo)了most高的Gal9募集。不同緩沖體系中的LNP對FT的反應(yīng)不同。PBS LNP減少了Gal9的招募,Tris LNPs幾乎沒有變化,HEPES LNPs增加了Gal9的招募。解凍后的HEPES LNPs內(nèi)涵體逃逸的增加可能是低溫透射電鏡觀察到的形態(tài)學(xué)變化的結(jié)果。LNP形態(tài)的變化導(dǎo)致體外轉(zhuǎn)染的增加,因此HEPES可能促進了解凍后LNP形態(tài)的有利變化。

這些體外實驗數(shù)據(jù)進一步支持了LNP緩沖液組成對凍融后轉(zhuǎn)染效率的重要性,并揭示了細胞攝取的差異受到這些變化的影響。

3.4 體內(nèi)成像評估m(xù)RNA表達情況

通過living body成像,探索了不同緩沖體系mRNA-LNP在體內(nèi)的表達情況。將HEPES、Tris和PBS LNPs靜脈注射到年齡匹配的雌性BALB/c小鼠中,比較熒光素酶的表達水平和apparatus特異性。在注射后4和24 h時間點測量新鮮和解凍的LNPs的生物發(fā)光信號。

在所有案例中,生物發(fā)光圖像顯示強烈的肝臟轉(zhuǎn)染模式,與通常的LNP靜脈注射制劑一致。

總體而言,HEK293T/17細胞系的體內(nèi)轉(zhuǎn)染趨勢與體外觀察到的相似(Tris > HEPES > PBS)。新鮮LNPs之間的交叉比較得出結(jié)論,與其他緩沖液相比,Tris組在給藥后4小時增加了2倍。這種功效的增強可能是由于脂質(zhì)膜上的水置換改善了apoe介導(dǎo)的攝取,正如脂質(zhì)膜厚度減少所表明的那樣。

然而,緩沖液導(dǎo)致了不同程度的轉(zhuǎn)染損失。對于給藥后4小時的FT組,HEPES顯示總通量減少約2倍,Tris顯示減少約3倍,PBS (LNP配方中most常見的緩沖液)導(dǎo)致總通量減少近9倍。

有趣的是,在24小時時間點,不同緩沖液樣品之間mRNA表達水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)上的outstanding差異。這可能是LNPs在血液中不斷循環(huán),緩沖液作用減弱的結(jié)果。

總的來說,與先前的觀察結(jié)果一致,mRNA的傳遞受到凍融過程的影響。緩沖液對體內(nèi)給藥效果的巨大影響表明,在LNP制備中選擇適宜的生物緩沖液,或可為保持mRNA-LNP的理化性質(zhì)及生物學(xué)活性提供outstanding優(yōu)勢。

4

結(jié)論

脂質(zhì)納米顆粒(LNP)通常通過透析或與生理緩沖液(如PBS)交換緩沖液來中和,純化后可直接注射入生物體。此外,緩沖體系可以作為冷凍保護劑,減輕LNP制劑在低溫儲存時的穩(wěn)定性問題。

值得注意的是,F(xiàn)DA批準的疫苗Spikevax和Comirnaty使用不同的緩沖液,這表明不同的mRNA-LNP制劑可能對緩沖體系有不同的要求。(筆者注:Comirnaty上市后制劑prescription中緩沖體系由PBS變更為了Tris,詳細信息請參考:《Moderna:使用TRIS緩沖體系可提高mRNA穩(wěn)定性》)

因此,為LNP制劑篩選適宜的緩沖體系是一個價值的研究課題。然而,緩沖體系對LNP的結(jié)構(gòu)形態(tài)、包封率和轉(zhuǎn)染效率方面的作用迄今尚未得到充分研究。

本文分享的研究中,使用常用陽離子脂質(zhì)DLin-MC3-DMA制備mRNA-LNP,在-20℃低溫冷凍3周,比較了LNP凍存前后的理化性質(zhì)和生物學(xué)活性(體外+體內(nèi))。

結(jié)果表明,通過體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染衡量,在HEPES和Tris體系中的LNPs總體上優(yōu)于PBS。與PBS相比,HEPES和Tris作為冷凍保護劑,可以在更大程度上保存LNPs的結(jié)構(gòu)和mRNA的遞送效率。

此外,儲存在HEPES中的LNPs在FT循環(huán)后形成了沙漏狀結(jié)構(gòu),而Tris和PBS在凍融后都產(chǎn)生了高度聚集的結(jié)構(gòu)。因此,HEPES可以為LNPs提供更好的保護,防止pH梯度急劇下降,防止LNP聚集,most終控制相分離過程。另一方面,使用Tris對轉(zhuǎn)染特別有益,這表明緩沖鹽等輔料在LNP制劑中的作用可能被much低估了。

通過分享該研究,艾偉拓產(chǎn)品團隊希望揭示LNP制劑prescription研發(fā)過程中,緩沖體系選擇的重要性,希望能夠為廣大核酸遞送企業(yè)及相關(guān)從業(yè)者帶來一定的參考。

未來,艾偉拓產(chǎn)品團隊也會持續(xù)關(guān)注核酸遞送制劑prescription相關(guān)研究進展,包括不同劑型(如凍干劑型)、不同存儲條件(如2~8℃冷藏存儲)、不同LNP脂質(zhì)組分及不同載荷等因素對LNP制劑輔料選擇的影響。

下一期,艾偉拓產(chǎn)品團隊將為您帶來《冷凍或凍干導(dǎo)致pH值變化及對應(yīng)緩沖體系篩選考量》,敬請期待!

如需了解更多相關(guān)信息,您也可以與所在區(qū)域艾偉拓銷售人員聯(lián)系,或掃描下圖中的二維碼聯(lián)系我們,預(yù)約艾偉拓產(chǎn)品團隊的專場報告!

艾偉拓近20年來始終專注于high-end注射級輔料,長期穩(wěn)定供應(yīng)注射級TRIS/TRIS-HCl、HEPES等生物緩沖體系,具有GMP條件生產(chǎn),中美雙報,供注射用,ultralow內(nèi)TOXIN,DNase& RNase free,符合國際主流藥典標準,現(xiàn)貨快速供應(yīng)等優(yōu)勢,助力mRNA疫苗等核酸制劑的研發(fā)生產(chǎn)與中外申報!

 

 

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